痰結(jié)核菌檢查應(yīng)在生物安全工作臺(tái)內(nèi)或在裝有過濾裝置的向室外排風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。

B1涂片檢查方法

B1.1直接涂片法

痰標(biāo)本：留取深咳痰標(biāo)本約3～5mL于廣口容器中。用折斷竹簽等物挑取膿樣痰液0.1mL.放入載玻片中央處，均勻涂抹成2cm×2.5cm的卵圓形痰膜，如圖B1.

自然干燥后，染色鏡檢。

涂片必須使用清潔、無劃痕的新載玻片，一張玻片涂一份標(biāo)本，載玻片只使用一次。

B1.2集菌痰涂法

痰標(biāo)本，留取深咳痰標(biāo)本或12～24h痰標(biāo)本5～10L，于消毒處理的玻璃容器（約120mL）中，如痰量少且粘稠時(shí)加適量蒸餾水（不超過10mL），經(jīng)高壓蒸氣滅菌器0.105MPa20～25min，冷卻后供集菌涂片用。

B1.2.1離心集菌涂片法：取上述處理后的痰液5～10mL（不超過10mL）入50mL離心管內(nèi)，加蒸餾水至50mL，以3000r/min轉(zhuǎn)速（1750g離心力），離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片，自然干燥后，染色鏡檢。

B1.2.2漂浮集菌涂片法：取上述處理的痰液5～10mL入120mL容積的玻璃瓶中，加蒸餾水20～30mL（總量不超過瓶容積的三分之一），加二甲苯0.3mL，放振蕩機(jī)上振蕩10min（振蕩機(jī)速率240次/min），取出平放臺(tái)上，加蒸餾水滿瓶口，靜置10～15min，把標(biāo)號(hào)的載玻片蓋于瓶口上。放置15～20min，取下玻片平放臺(tái)上，自然干燥后，染色鏡檢。

B1.3染色方法

B1.3.1抗酸染色法（Ziehl－Neelsen法）

B1.3.1.1染色劑配制

B1.3.1.1.1染色劑：取堿性復(fù)紅8g，溶解于95%酒精100mL內(nèi)，加5%石炭酸900mL，放置24h后過濾備用。

B1.3.1.1.2脫色劑：5%鹽酸酒精。

B1.3.1.1.3復(fù)染劑：取亞甲藍(lán)0.15g溶入95%酒精50mL，加蒸餾水至1000mL.

B1.3.1.2染色步驟

B1.3.1.2.1痰涂片火焰固定，平放染色架上。

B1.3.1.2.2加染色劑蓋滿痰膜，微火加溫至染液呈現(xiàn)蒸汽，去火焰，染色5～10min（勿使染液呈現(xiàn)干涸），水洗。

B1.3.1.2.3加脫色劑蓋滿痰膜，脫色3～5min，至無紅色，水洗。

B1.3.1.2.4加復(fù)染劑蓋滿痰膜，直接涂片復(fù)染30s，集菌涂片復(fù)染1～3min，水洗，干后，鏡檢。

痰涂片染色質(zhì)量要求，涂片染色后，肉眼觀察痰膜呈淡藍(lán)或藍(lán)色，不得有紅色斑塊，痰膜脫落部分在10%以下。鏡下所見，視野背景清晰。在100×物鏡的視野內(nèi)于淡藍(lán)色背景下，抗酸菌呈紅色桿菌，其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。

B1.3.1.3鏡檢與報(bào)告

顯微鏡下（目鏡10×，油鏡100×）所見結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)如下：

B1.3.1.3.1鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)視野（觀察時(shí)間不少于4min），未發(fā)現(xiàn)抗酸菌者繼續(xù)觀察至300個(gè)視野，仍未發(fā)現(xiàn)抗酸菌者報(bào)告抗酸菌陰性（一）。

B1.3.1.3.2鏡檢100～300個(gè)視野找到抗酸桿菌1～2條者，報(bào)告抗酸桿菌可疑（±），或重新涂片或另留痰標(biāo)本復(fù)查。

B1.3.1.3.3鏡檢100個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌3～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性（1＋）。

B1.3.1.3.4鏡檢10個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌1～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性（2＋）。

B1.3.1.3.5鏡檢每個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌1～9條者，報(bào)告抗酸桿菌陽性（3＋）。

B1.3.1.3.6鏡檢每個(gè)視野內(nèi)找到抗酸桿菌多于9條以上者，報(bào)告抗酸桿菌陽性（4＋）。

在痰涂片檢查報(bào)告中應(yīng)包括痰標(biāo)本的性狀和質(zhì)量。

B1.3.1.4質(zhì)量控制要求

為保證痰涂片檢查質(zhì)量，應(yīng)建立和健全室內(nèi)、室間痰菌涂片檢查質(zhì)量控制制度。室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)包括痰標(biāo)本收集、涂片、染色標(biāo)準(zhǔn)和鏡檢結(jié)果復(fù)核等，室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)每日進(jìn)行，繪制質(zhì)控圖。痰涂片保存供上一級(jí)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控檢查。

室間質(zhì)控由上一級(jí)實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行。

痰涂片鏡檢結(jié)果質(zhì)量要求，痰涂片陰性符合率在95%以上，涂片陽性符合率在98%以上，總符合率在96.5%以上。“1＋”以上的陽性痰片不允許出現(xiàn)假陰性。

B1.3.2熒光素染色法（金胺O法）

B1.3.2.1染色劑配制

B1.3.2.1.1染色劑：取金胺0.01g溶于95%酒精10mL內(nèi)。加5%石炭酸至100mL.

B1.3.2.1.2脫色劑：3%鹽酸酒精。

B1.3.2.1.3復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。

B1.3.2.2染色步驟

B1.3.2.2.1痰涂片火焰固定，平放染色架上。

B1.3.2.2.2加染色劑蓋滿痰膜，染色10～15min，水洗。

B1.3.2.2.3加脫色劑蓋滿痰膜，脫色3～5min，至無黃色，水洗。

B1.3.2.2.4加復(fù)染劑蓋滿痰膜，染色2min，水洗。干后，鏡檢。

B1.3.2.3鏡檢與報(bào)告

在暗色背景下，抗酸桿菌呈黃綠色或銀白色熒光。

熒光顯微鏡檢查，20×物鏡計(jì)數(shù)，40×物鏡觀察抗酸桿菌形態(tài)，也有用40×物鏡計(jì)數(shù)，菌體形態(tài)清楚，判斷準(zhǔn)確。

熒光染色后應(yīng)在24h內(nèi)完成檢查，需隔夜時(shí)，置痰涂片于暗處保存，次日完成檢查。

熒光顯微鏡20×物鏡鏡檢結(jié)果按下列標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告：

B1.3.2.3.130視野內(nèi)未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，報(bào)告抗酸桿菌陰性（一）。

B1.3.2.3.230視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1～9條，報(bào)告抗酸桿菌條數(shù)。應(yīng)以抗酸染色法（見B1.3.1）復(fù)染或涂片復(fù)檢結(jié)果報(bào)告之醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理。

B1.3.2.3.330視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌10～100條，報(bào)告抗酸桿菌陽性（1＋）。

B1.3.2.3.4平均每一視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1～10條，報(bào)告抗酸桿菌陽性（2＋）。

B1.3.2.3.5平均每一視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌11～200條，報(bào)告抗酸桿菌陽性（3＋）。

B1.3.2.3.6平均每一視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌多于200條，報(bào)告抗酸桿菌陽性（4＋）。

B2分枝桿菌培養(yǎng)方法

B2.1培養(yǎng)基

B2.1.1改良羅氏培養(yǎng)基

成分：

味精（谷氨酸鈉95%以上）7.2g；磷酸二氫鉀2.4g；硫酸鎂0.24g；檸檬酸鎂0.6g；甘油12mL；蒸餾水600Ml；馬鈴薯淀粉30g；全卵液1000mL；2%孔雀綠20mL。

制備法：各鹽類成分溶解后，加馬鈴薯淀粉，混勻，沸水鍋內(nèi)煮沸30～40min（其間不時(shí)搖動(dòng)，防凝塊），呈糊狀，待冷后，加入經(jīng)消毒紗布過濾的新鮮全卵液1000mL，混勻。加2%孔雀綠20mL，混勻，分裝試管（18mm×180mm）。每一試管加培養(yǎng)基7mL，培養(yǎng)基斜面高度為培養(yǎng)基占試管底部的三分之二處為宜，置血清凝固器內(nèi)凝固。

凝固器內(nèi)溫度至90℃時(shí)，放入分裝試管，以擺放兩層為宜。待凝固器內(nèi)溫度達(dá)85～90℃，計(jì)時(shí)，凝固1～1.5h后取出，放冷，無菌試驗(yàn)后放4℃冰箱備用，一個(gè)月內(nèi)使用。

制備的培養(yǎng)基顏色鮮艷，表面光滑濕潤(rùn)，有一定韌性和酸堿緩沖能力。

B2.1.2丙酮酸鈉培養(yǎng)基

成分同改良羅氏培養(yǎng)基，除去甘油，加丙酮酸鈉1.6g，以10%氫氧化鈉調(diào)pH7.2，加葡萄糖4g，其他同改良羅氏培養(yǎng)基制備法。

B2.1.3酸性羅氏培養(yǎng)基

成分同改良羅氏培養(yǎng)基，把其中磷酸二氫鉀增加至14g，其他同改良羅氏培養(yǎng)基制備法。

B2.1.43%小川培養(yǎng)基

成分：

磷酸二氫鉀3g；谷氨酸鈉1g；甘油6mL；蒸餾水100mL；全卵液200mL；2%孔雀綠6mL。

制備方法，同改良羅氏培養(yǎng)基。

雞卵消毒法：

新鮮雞卵經(jīng)自來水清洗，肥皂水刷洗干凈，待干后以75%酒精擦拭消毒。在無菌操作下把卵液倒入已滅菌的有刻度搪瓷杯內(nèi)，滅菌紗布過濾入培養(yǎng)基中，加2%孔雀綠，混勻分裝、凝固。

B2.2前處理方法

B2.2.1堿處理法（用于酸性羅氏培養(yǎng)基和3%小川培養(yǎng)基）

B2.2.1.12%氫氧化鈉，取2g氫氧化鈉，溶于80mL蒸餾水內(nèi)全溶后，加水至100mL.

B2.2.1.2處理方法，取痰標(biāo)本1mL加2%氫氧化鈉2～4mL，室溫30min，其間振蕩2～3次，促痰液化。

B2.2.2酸處理法（用于改良羅氏培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基）

B2.2.2.12%硫酸液，取濃硫酸2mL緩緩加入蒸餾水90mL內(nèi)，加水至100mL.

B2.2.2.2處理方法，取痰標(biāo)本1mL加2%硫酸2～4mL，室溫30min，其間振蕩（或用碎痰器打碎痰液）2～3次，促痰液化。

B2.3接種方法

取消化后痰液混勻，以滅菌刻度毛細(xì)吸管取0.1mL.緩緩均勻地接種每支培養(yǎng)基斜面上，每份痰標(biāo)本接種二支培養(yǎng)基，接種畢，放37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

B2.4結(jié)果與報(bào)告

接種后應(yīng)每周觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，陽性生長(zhǎng)經(jīng)涂片染色驗(yàn)證后隨時(shí)報(bào)告，培養(yǎng)至8周未見細(xì)菌生長(zhǎng)，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性（如進(jìn)行菌種鑒定，應(yīng)于接種后3天、7天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，而后每周觀察至8周）。

培養(yǎng)結(jié)果按下列標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告：

培養(yǎng)8周未見菌落生長(zhǎng)，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性（一）。

培養(yǎng)基斜面菌落生長(zhǎng)20個(gè)以下，報(bào)告分枝桿菌陽性與菌落數(shù)。

培養(yǎng)基斜面菌落分散生長(zhǎng)，占據(jù)斜面1/4以下者，報(bào)告分枝桿菌陽性（1＋）。

培養(yǎng)基斜面菌落分散生長(zhǎng)，占據(jù)斜面1/2以下者，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2＋）。

培養(yǎng)基斜面菌落密集生長(zhǎng)或部分融合，占據(jù)斜面3/4以下者，報(bào)告分枝桿菌陽性（3＋）。

培養(yǎng)基斜面菌落密集生長(zhǎng)呈菌苔樣分布，占據(jù)全斜面者，報(bào)告分枝桿菌陽性（4＋）。

B2.5培養(yǎng)基污染情況報(bào)告

觀察分枝桿菌生長(zhǎng)情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)非分支桿菌生長(zhǎng)時(shí)，報(bào)告污染菌生長(zhǎng)，污染率高于5%時(shí)，提示培養(yǎng)基制備中滅菌處理不佳或消化液處理不良，應(yīng)認(rèn)真檢查操作程序。

污染菌程度按下列標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告：

B2.5.1污染菌生長(zhǎng)占培養(yǎng)基斜面1/4以下者，報(bào)告（C1＋）。

B2.5.2污染菌生長(zhǎng)占培養(yǎng)基斜面1/2以下者，報(bào)告（C2＋）。

B2.5.3污染菌生長(zhǎng)占培養(yǎng)基斜面3/4以下者，報(bào)告（C3＋）。

B2.5.4污染菌生長(zhǎng)占培養(yǎng)基全斜面者，報(bào)告（C4＋）。

B2.5.5培養(yǎng)基液化者，報(bào)告（LQ）。