[醫(yī)學(xué)免疫學(xué)]測定蛋白樣品中某種分子量的蛋白選用最佳的方法是

原題:
[醫(yī)學(xué)免疫學(xué)]測定蛋白樣品中某種分子量的蛋白選用最佳的方法是
選項(xiàng):
A.免疫PCR
B.免疫沉淀法
C.免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)
D.斑點(diǎn)雜交
E.Southem blotting

答案:
C
解析:

答復(fù):本題選C。

  Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測。

  一、原理與Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

  二、操作步驟

 。ㄒ唬┑鞍踪|(zhì)樣品獲得:細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞,真核細(xì)胞加勻漿緩沖液,機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min.然后4℃,13,000g離心15min.取上清液作為樣品。

 。ǘ╇娪荆褐苽潆娪灸z,進(jìn)行SDS-PAGE.

  (三)轉(zhuǎn)移:(半干式轉(zhuǎn)移)

  1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小,用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡,5min×3次。

  2、膜處理:預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min. 3、轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2,轉(zhuǎn)移1.5hr.轉(zhuǎn)移結(jié)束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結(jié)果作對(duì)比。

 。ㄋ模┟庖叻磻(yīng):1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。

  2、加入包被液,平穩(wěn)搖動(dòng),室溫2hr. 3、棄包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。

  4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部),4℃ 放置12hr以上。陰性對(duì)照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

  5、棄一抗和1%BSA,用0.01M PBS分別洗膜,5min×4次。

  6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋),平穩(wěn)搖動(dòng),室溫2hr. 7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。

  8、加入顯色液,避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

  三、注意事項(xiàng)

  1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。

  2、顯色液必須新鮮配置使用,最后加入H2O2. 3、DAB有致癌的潛在可能,操作時(shí)要小心仔細(xì)。

特別推薦RSS | 地圖 | 最新