醫(yī)學檢驗大致可分為形態(tài)學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學等廣泛領(lǐng)域中有相當高的實際應(yīng)用價值。

　　常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：

　　① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

　　② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

　　③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。

　　Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

　　呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測的金標準是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點。一般認為樣本中內(nèi)要有100個左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計的引物擴增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。

　　而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結(jié)核菌痰標本的PCR檢測應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時間后再復檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至會導致嚴重非特異性擴增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

　　循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進入血液，最終可定位于心肌細胞中導致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應(yīng)超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

　　PCR檢測在性傳播性疾病（STD）的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。

　　16s RNA基因設(shè)計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時應(yīng)以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV），可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

　　我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導致細胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒灄l件下具有潛在誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous（1911）的實驗，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導宿主細胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產(chǎn)物與細胞生長、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、  mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導細胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機理有：

　?、冱c突變，受到射線、化學因素、生物因素的誘導，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。

　?、讷@得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。

　?、刍蛞孜唬瑑?nèi)外界因素能導致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。

　?、茉┗虻倪^量擴增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達時，會因調(diào)控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53.抑癌基因較復雜，作用機理不太清楚。

　　癌基因檢測中常用的分子生物學技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發(fā)腫瘤時點突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。

　　P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。 1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導致構(gòu)型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測。

　　遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預(yù)計與遺傳相關(guān)的疾病的檢測有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria，PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。

　　此病患者出生時正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點雜交能有效診斷PKU.遺傳性疾病的基因變化很復雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

　　優(yōu)生學包括基礎(chǔ)優(yōu)生學、社會優(yōu)生學、臨床優(yōu)生學及環(huán)境優(yōu)生學。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴重影響的疾病如風疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發(fā)現(xiàn)及時治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術(shù)可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內(nèi)診斷。可見PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價值。

　　PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內(nèi)含子中的串聯(lián)重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。

　　由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標記。使用PCR技術(shù)對其進行擴增結(jié)合對擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復片段的數(shù)量不同而且重復片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時，如再結(jié)合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告?zhèn)?、PCR擴增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。