利用抗原抗體特異結(jié)合的特性，用免疫測定技術(shù)定量或定性檢測細(xì)胞因子。盡管細(xì)胞因子種類繁多，但只要獲得了針對某一細(xì)胞因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體），即可采用免疫測定法進(jìn)行檢測。常用的方法包括ELISA、RIA、免疫印跡法、免疫熒光法以及基于免疫熒光技術(shù)的流式細(xì)胞儀分析法。

一、ELISA方法

ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISA的基本步驟，可作定性或定量分析。雙抗體夾心法是用于細(xì)胞因子測定的最常用方法，該法使用的抗體可以是針對同一抗原的多克隆抗體，也可以是針對同一抗原的不同抗原表位的單克隆抗體。

細(xì)胞因子測定的標(biāo)本主要包括兩大類，一是血清（血漿）、關(guān)節(jié)液、胸腔液、腦脊液或腹腔液等體液，可用于細(xì)胞因子和可溶性黏附分子的檢測；二是細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液，只用于細(xì)胞因子的檢測。

ELISA法具有特異、簡便、易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，可同時檢測大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理，成為細(xì)胞因子測定的首選方法。此外，無生物學(xué)活性的細(xì)胞因子前體、分解片段以及與相應(yīng)受體的結(jié)合物也可用此法檢測。其缺點(diǎn)是敏感性偏低、不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。

二、流式細(xì)胞分析法

流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面黏附分子的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進(jìn)行單個細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或黏附因子的檢測，精確判斷不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。根據(jù)熒光抗體的性質(zhì)，熒光抗體染色分直接法和間接法，前者使用熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子或黏附分子的特異性抗體，后者則用熒光標(biāo)記二抗。直接法較為常用，其敏感性雖不及間接法，但特異性強(qiáng)。

該法檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子時，主要包括以下基本步驟：

1.分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞

2.細(xì)胞固定 常用的細(xì)胞固定劑為4%多聚甲醛。

3.封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 即用含5%脫脂奶粉和鈣、鎂離子的PBS溶液，重懸已固定的細(xì)胞。

4.染色與分析 即用熒光素標(biāo)記的細(xì)胞因子特異性單克隆抗體做熒光抗體染色，用流式細(xì)胞儀分析熒光陽性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度。此外，若應(yīng)用不同熒光素標(biāo)記兩種以上細(xì)胞因子的單克隆抗體，則可同時檢測同一細(xì)胞內(nèi)2種以上不同的細(xì)胞因子。

應(yīng)用此法還可區(qū)分具有不同分泌特性的細(xì)胞亞群，如Th1、Th2細(xì)胞等。

三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT），源自ELISA，但又突破傳統(tǒng)ELISA，是定量測定抗體形成細(xì)胞技術(shù)的延伸和發(fā)展，已被愈來愈多地應(yīng)用于類風(fēng)濕因子、IFN-γ等細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的定量測定。

ELISPOT優(yōu)于傳統(tǒng)抗體、細(xì)胞因子或其他可溶性分子分泌細(xì)胞的檢測方法，能從20萬～30萬個細(xì)胞中檢測出1個分泌相應(yīng)分子的細(xì)胞，若引人生物素與親和素系統(tǒng)，敏感性還將大大提高。在作ELISPOT時，選擇的特異性抗體應(yīng)該具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的特性。選用的細(xì)胞激活物必須不影響細(xì)胞的分泌功能。

四、免疫學(xué)測定方法學(xué)評價

免疫測定法幾乎可以用于所有細(xì)胞因子的檢測，與生物活性測定法相比，其主要優(yōu)缺點(diǎn)分別是：

優(yōu)點(diǎn)：①特異性高，使用特異的單克隆抗體，可用于單一細(xì)胞因子的檢測；②操作簡便、快速，無需依賴細(xì)胞株，故不需維持培養(yǎng)，使方法的可操作性大大增加，容易推廣和便于普查；③影響因素相對較少且容易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。

缺點(diǎn)：①所測定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定成正比；②測定結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系，使用不同來源親和力的單抗，對同一標(biāo)本測到的結(jié)果可能不同；③敏感性相對較低，比生物活性法約低10～100倍，測定下限一般為100pg；④若標(biāo)本中存在細(xì)胞因子的可溶性受體，可能會影響特異性抗體對細(xì)胞因子的結(jié)合。

除上述介紹的方法外，同屬生物學(xué)測定方法的分子生物學(xué)技術(shù)，在細(xì)胞因子或黏附分子檢測方面應(yīng)用也十分廣泛，諸如PCR/RT-PCR、斑點(diǎn)雜交、Northern-blot，以及包括FISH在內(nèi)的細(xì)胞或組織原位雜交等。

其他免疫測定法：偏振熒光檢測技術(shù)；激光共聚焦顯微鏡的使用；發(fā)光技術(shù)；免疫組化染色。所有這些方法都在黏附分子、細(xì)胞因子及其分泌細(xì)胞的檢測方面發(fā)揮了積極的作用。

……

查看更多：//bbs.med66.com/forum-267-250/topic-1569763.html