時間分辨熒光免疫測定（TRFIA），跟著小編來學習一下吧！

用鑭系元素標記抗原或抗體，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨。

（一）基本原理

1.時間分辨

正常組織在激發(fā)光照射下可以發(fā)出一定波長的熒光，但該熒光壽命較短（1～10ns），而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長（10～1000μs）。故待短壽命背景熒光完全衰變后再測定鑭系元素離子螯合物的特異性熒光信號。

2.Stokes位移：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差，如果Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結果的準確性。鑭系元素位移大。

3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：鑭系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm±1Onm。利用濾光片只允許此波段的熒光通過，避免干擾。

4.熒光標記物的相對比活性：比活性是指單位時間內每個標記分子可被探測到的信號量。

5.信號增強

Eu3＋標記抗原抗體復合物在弱堿性溶液中被激發(fā)后的熒光信號較弱，加入一種酸性增強液可使Eu3＋從復合物上完全解離下來，并與另一種螯合劑所螯合，以增強熒光信號。

（二）標記物和標記方法

1.標記物：多用Eu3＋和Tb3＋為標記物，其中Eu3＋最為常用。

2.標記方法：鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體結合，需應用具有雙功能基團的螯合劑，其一端與鑭系元素離子結合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結合。

（三）方法類型

1.雙抗夾心法：待檢抗原與固相抗體結合，再與Eu3+標記抗體結合，在酸性環(huán)境下，復合物上的Eu3+解離下來，在340nm激發(fā)光照射下，形成熒光。

2.固相抗體競爭法：待檢抗原和Eu3＋標記的抗原與固相抗體競爭結合，熒光強度與待檢抗原成反比。

3.固相抗原競爭法：待檢抗原和固相抗原競爭Eu3＋標記抗體，熒光強度與待檢抗原含量成反比。

（四）方法評價

1.優(yōu)點：

靈敏度高；分析范圍寬；標記結合物穩(wěn)定，有效使用期長；測量快速，易自動化；無放射性污染。

2.缺點：

易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染，使本底增高。

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