熒光抗體的制備有哪些要求呢？快來跟著小編了解一下吧！

（一）抗體要求

將熒光素與特異性抗體以化學(xué)共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。

（二）熒光素要求　異硫氰酸熒光素最常用

要求：

①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除；

②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率；

③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明；

④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)；

⑤標(biāo)記方法簡單、安全無毒；

⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

（三）抗體的熒光素標(biāo)記

1.攪拌法：適用于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少。但易引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。

2.透析法：適用于標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻，非特異染色也較低。

（四）熒光素標(biāo)記抗體的純化

抗體標(biāo)記完成后，還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體作進(jìn)一步純化，以去除未結(jié)合的游離的熒光素。

純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。

（五）熒光抗體的鑒定

1.熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率　熒光素與蛋白的過量結(jié)合是非特異熒光著色的來源之一，而未結(jié)合者有抑制特異性熒光抗體反應(yīng)的作用。

熒光素結(jié)合到蛋白上的量的重要指標(biāo)是熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率（F/P）。比值越大，則抗體結(jié)合的熒光素越多，反之則結(jié)合越少。一般用于組織切片的熒光抗體，其F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色F/P＝2.4為宜。

2.抗體效價(jià)　可以采用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測定，抗原含量為1g/L時(shí)，抗體效價(jià)＞1:16者較為理想。

3.抗體特異性①吸收試驗(yàn)：向熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原反應(yīng)后，再用于陽性標(biāo)本染色，應(yīng)不出現(xiàn)明顯熒光；②抑制試驗(yàn)：陽性標(biāo)本先與相應(yīng)未標(biāo)記抗體反應(yīng)，洗滌后，再加熒光抗體染色，熒光強(qiáng)度應(yīng)受到明顯抑制。

（六）熒光抗體的保存

防止抗體失活和防止熒光淬滅。

小量分裝，-20℃凍存可保存2～3年。

真空干燥后可長期保存。

稀釋后的抗體不宜長時(shí)間保存，在4℃可保存1～3天。

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