間接血凝試驗(yàn)的具體操作過程是什么?
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1.載體
紅細(xì)胞是大小均一的載體顆粒,最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及O凝型人紅細(xì)胞。
新鮮紅細(xì)胞能吸附多糖類抗原,但吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力較差。
致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短,且易變脆、溶血和污染,只能使用2~3d.為此一般在致敏前先將紅細(xì)胞醛化,可長期保存而不溶血。
常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。
紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積略有增大,兩面突起呈圓盤狀。醛化紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力,血凝反應(yīng)的效果基本上與新鮮紅細(xì)胞相似。如用兩種不同醛類處理效果更佳。也可先用戊二醛,再用鞣酸處理。
醛化紅細(xì)胞能耐60C的加熱,并可反復(fù)凍融不破碎,在4℃環(huán)境中可保存3-6個(gè)月,在一20℃的環(huán)境中可保存1年以上。
2.致敏
致敏用的抗原或抗體要求純度高,并保持良好的免疫活性。
用蛋白質(zhì)致敏紅在低pH,低離子濃度下,用醛化紅細(xì)胞直接吸附即可。
間接法則需用耦聯(lián)劑將蛋白質(zhì)結(jié)合到紅細(xì)胞上。常用耦聯(lián)劑為雙耦氮聯(lián)苯胺(bis-diazotized benzidine,BDB)和氯化鉻。前者通過共價(jià)鍵,后者通過金屬陽離子靜電作用使蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞表面結(jié)合而達(dá)到致敏的目
3.血凝
試驗(yàn)可在微量滴定板或試管中進(jìn)行,將標(biāo)本倍比稀釋,一般為1:64,同時(shí)設(shè)不含標(biāo)本的稀釋液對照孔。
在含稀釋標(biāo)本1滴的板孔(或試管)中,加入0.5%致敏紅細(xì)胞懸液1滴,充分混勻,置室溫1~2h,即可觀察結(jié)果。
凡紅細(xì)胞沉積于孔底,集中呈一圓點(diǎn)的為不凝集。如紅細(xì)胞凝集,則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱,以抖凝集的孔為滴度終點(diǎn)。
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